Тем не менее, большой круг биологических систем, не обладающих парамагнитными свойствами, остается недоступен для метода ЭПР. Расширить сферу его применений позволяют спиновые зонды, или спиновые метки, которые вводят в исследуемую систему. Это молекулы или молекулярные фрагменты со стабильным неспаренным электроном, спектр ЭПР которых зависит от интересующих исследователя свойств системы. Термин «спиновая метка», как правило, относят к парамагнитным молекулярным фрагментам, ковалентно «пришитым» к какой-либо из «натуральных» молекул изучаемой системы. Спиновыми зондами чаще называют свободные парамагнитные молекулы, добавленные в биологическую систему. Метод спиновых меток (зондов) возник и получил развитие благодаря работам А.Б.Неймана, А.Л.Бучаченко, А.Н.Кузнецова, Г.И.Лихтенштейна, Х.Мак Коннелла и др.

Парамагнитные фрагменты спиновых меток могут иметь различную химическую природу. Часто используют так называемые нитроксильные радикалы, в которых группа (>N-O) содержит нечетное число электронов (семь электронов атома азота и восемь — кислорода) и обладает нескомпенсированным парамагнитным моментом (одноэлектронное восстановление или окисление молекулы зонда приводит к потере парамагнитных свойств молекулы). В спектре ЭПР нитроксильных радикалов обычно хорошо заметна так называемая сверхтонкая структура. возникающая за счет взаимодействия неспаренного электрона с ядром азота; она «размывается» при высоких концентрациях метки и очень чувствительна к вязкости ее микроокружения. Это позволило изучить с помощью спиновых меток физические структурные перестройки макромолекул, свойства биологических мембран и др. Большая заслуга в развитии применений спиновых меток при изучении фотосинтеза принадлежит ученику Блюменфельда А.Н.Тихонову.

Среди множества применений спиновых меток остановимся на двух — на решении задач оксии рН-метрии. Во многих биологических исследованиях необходимо измерять содержание кислорода в среде. Взаимодействие этого парамагнитного вещества с молекулами спиновых зондов приводит к уширению линии в спектре ЭПР-зонда. Чем выше концентрация кислорода в среде, тем чаще его молекулы сталкиваются с молекулами зонда, тем заметнее увеличивается ширина спектральных линий, которая и служит оценкой содержания кислорода в среде.

В клетках аэробных организмов кислород участвует в главных энергетических процессах: в дыхании и в фотосинтезе (при так называемом оксигенном фотосинтезе, характерном для цианобактерий и зеленых растений). Для дыхания кислород необходим как реагент, а в ходе фотосинтеза он образуется как побочный продукт при окислении воды, которая служит источником электронов для восстановления атмосферного углекислого газа до органических соединений. Тем не менее кислород необходим и в реакциях фотосинтеза. Проследить за его участием в них можно с помощью метода ЭПР. Он позволяет одновременно наблюдать за переносом электронов в фотосинтетических мембранах и за изменениями концентрации кислорода в среде. Для этих исследований мы использовали кислород-чувствительный спиновый зонд. Сверхтонкая структура спектральных линий этого зонда разрешается лишь в деаэрированной среде. В данном случае это позволило контролировать газообмен клеток в условиях, практически недоступных для применения других методов измерения содержания кислорода в среде.

Не менее часто спиновые зонды применяют в качестве рН-индикаторов. Они незаменимы при изучении таких микроскопических объектов, как клеточные органеллы. Если для целых клеток, в принципе, еще можно использовать микроэлектродную технику, то субклеточные компартменты уже слишком малы. В то же время именно в таких микрообъемах часто необходимо знать об изменениях pH в ходе физиологических процессов. Так, долгое время один из ключевых вопросов в энергетике фотосинтеза был связан с величиной ДрН, возникающей на мембране тилакоидов — замкнутых образований внутри хлоропластов. Ранние оценки этой величины давали заметно завышенное значение — от трех до четырех и более единиц pH. Лишь работы последних 10 — 15 лет, в немалой степени благодаря спиновым зондам, показали, что эта разность рН составляет всего около двух единиц.

Каким же образом спиновые зонды могут служить индикаторами pH? Здесь возможны разные подходы. Один из них основан на перераспределении молекул зонда между клеточными ком-партментами при изменении их pH. Способность молекулы зонда протонироваться при определенных pH (в совокупности с различной проницаемостью мембраны для ее протонированной и депротонированной форм) обеспечивает при закислении какого-либо компартмента (в наших опытах тилакоиды) накопление в нем молекул зонда. При этом количество их связано с величиной трансмембранной разности pH. Определить ее можно различными методами, в том числе добавляя в среду парамагнитные соли, не проникающие через мембрану внутрь тилакоидов. Их взаимодействие с молекулами зонда существенно увеличивает ширину (и, соответственно, уменьшает величину) спектральных линий основной («внешней») фракции зонда. На этом фоне становятся различимы узкие линии спектра относительно небольшой доли молекул зонда, локализованных в тилакоидах. По величине неизмененных спектральных линий внутритилакоидной фракции можно определить количество поглощенных молекул, а следовательно, и трансмембранную разность pH.

Для определения количества поглощенного тилакоидами зонда используют также и другой метод, основанный на концентрационном уширении спектра ЭПР. Оно заключается в том, что с ростом концентрации парамагнитных молекул в среде увеличивается ширина спектральных линий ЭПР и одновременно снижается их величина. На свету, при закислении внутреннего пространства тилакоидов, концентрация зонда внутри них оказывается много большей, чем в окружающей среде, и более широкий спектр внутритилакоидной фракции зонда будет давать меньший вклад в общую величину сигнала ЭПР. В итоге при освещении суспензии хлоропластов, в которую добавлен спиновый зонд, его сигнал ЭПР обратимо уменьшается. Уменьшение сигнала (ДI) зависит от трансмембранной разности pH на мембране тилакоида и, следовательно, может служить для ее определения.

Другой подход в применении спиновых зондов для внутриклеточного измерения pH основан непосредственно на измерении характеристик спектров ЭПР, чувствительных к pH среды. Поиск соединений, обладающих pH-чувствительными спектральными характеристиками, химически устойчивых в живых системах и при этом не токсичных для них, — задача непростая. Чувствительность спектров ЭПР таких зондов к pH основана на взаимодействии их протонируемой группы и свободнорадикального фрагмента. Неспаренный электрон в молекуле зонда локализован преимущественно между атомами азота и кислорода нитроксильной группы. Протонирование атома азота в третьем положении имидазольного кольца за счет электростатического взаимодействия приводит к перераспределению плотности неспаренного электрона. Смещение электронной плотности в сторону атома азота увеличивает интенсивность магнитного взаимодействия его ядра с электроном и «раздвигает» компоненты сверхтонкого расщепления в спектре ЭПР. Смещение электронной плотности в сторону кислорода, наоборот, ослабляет сверхтонкое взаимодействие электрона с ядром азота, и расстояние между спектральными компонентами уменьшается. В последние годы целый ряд новых pH-чувствительных спиновых зондов синтезирован в Новосибирском институте органической химии им.Н.Н.Ворожцова СО РАН группой И.А.Григорьева. Эти зонды позволили изучать образование трансмембранной ДpH, возникающей на тилакоидной мембране хлоропластов высших растений в разных физиологических состояниях.

Явление электронного парамагнитного резонанса, открытое в середине XX в. в области соприкосновения нескольких «горячих точек» физики того времени — радиофизики, квантовой физики, физики атома и атомного ядра, — дало науке новый мощный метод исследования. В биологию этот метод вошел полвека назад, что заметно способствовало ее развитию и принесло существенные плоды.

Добавить комментарий